水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析检测技术的建立及应用

【摘要】水产品中兽药残留问题日益突出，兽药虽在养殖过程中带来不少作用，但摄入人体后对人体危害大，严格把控水产品中的兽药残留就显得尤为重要。恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）是第三代喹诺酮类药物，由于其在组织液中浓度达到最高值速度快、组织分布范围广、抑菌的数量和种类多等诸多优点，且其代谢产物均有良好的抗菌作用，所以广泛应用于水产养殖中的疾病防治。由于部分养殖户存在不规范用药，容易导致恩诺沙星随着食物链进入人体，造成软骨组织、中枢神经、消化系统等方面的损伤，同时较大剂量还会造成神经系统的迟缓、肝脏损伤及皮肤过敏等个方面的问题。本文通过采用胶体金免疫检测法，研究适用于现场快速监测水产品中ENR残留的检测体系。胶体金免疫层析法具有检测速度快、检测结果准确等优点，非常适用于这类现场快速检测。本次研究主要获得以下结果：1．ENR-OVA人工抗原的合成。采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将ENR偶联到OVA上，经FPLC、紫外、SDS-PAGE电泳等的检测分析，ENR与OVA偶联成功，可以用于进一步试验；2．多克隆抗体的制备。利用人工合成的抗原ENR-OVA免疫新西兰大白兔，抗血清经饱和硫酸铵法纯化后，用ELISA间接竞争法测得效价在1:8000~1:64000。其中以1号兔子的抗血清效果较佳，在此基础上建立的ELISA间接竞争法，检测ENR浓度在0.1~8.1ng/mL之间，以结合率B/B0值为纵坐标，标准品浓度为横坐标作曲线，通过拟合曲线获得方程：y=-40.613lg(x)+58.963，R2=0.9959，IC50为1.662。3．胶体金制备。采用Frens法制备出20nm左右的胶体金颗粒，用K2CO3调pH到8.2，然后逐滴加入2mL0.1mg/mL的ENR-PcAb溶液，用BSA封闭，采用高速离心法纯化，最终获得深红色胶体金溶液。4．试纸条制备工艺确定。胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体喷膜量为65μL/cm2；Millipore的M180NC膜；检测线和质控线（划膜量均为1.0μL/cm）；ENR-OVA和羊抗兔IgG包被浓度均为1000mg/L；样品垫前处理，用含1%PVP的0.01mol/LPBS(pH7.5)。采用此工艺制备出的试纸条最低检测限可低至0.9ng/mL，在虾和鱼组织中肉眼最低检测限分别为5ng/g、10ng/g。与ELISA间接竞争法比对中，试纸条对虾、鱼中ENR浓度分别大于5ng/mL、10ng/mL的样本，均能有效检出阳性，而低于该值时显色为阴性。试纸条在常温干燥条件下至少可保存一年。
【作者】余法建；
【导师】水柏年；
【作者基本信息】浙江海洋学院，渔业，2014，硕士
【关键词】恩诺沙星；胶体金免疫层析；兽药残留；水产品；

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